a cromatografia, cunnisciuta ancu com'è "analisi cromatografica", "cromatografia", hè un metudu di separazione è analisi, chì hà una larga gamma di applicazioni in chimica analitica, chimica organica, biochimica è altri campi.
U fundatore di a cromatografia hè un botanicu russu M.Tsvetter.In u 1906, u botanicu russu Zvetter pubblicò i risultati di u so esperimentu: Per separà i pigmenti di a pianta, hà versatu l'estratto di etere di petroleum chì cuntene pigmenti vegetali in un tubu di vetru chì cuntene carbonate di calcium in polvere è l'elute cù etere di petroleum da cima à fondu.Perchè i diversi pigmenti anu diverse capacità di adsorzione nantu à a superficia di particeddi di carbonate di calcium, cù u prucessu di lixiviazione, i pigmenti diffirenti si movenu à diverse velocità, formando bande di culori diffirenti.I cumpunenti di pigmentu sò stati separati.Hà chjamatu stu metudu di separazione cromatografia.
Rappresentazione schematica di un esperimentu di separazione di pigmenti di foglie di pianta
Cù u sviluppu cuntinuu di i metudi di separazione, più è più sustanzi incolori diventanu l'ughjettu di a separazione, a cromatografia hà ancu persu gradualmente u significatu di "culore", ma u nome hè sempre in usu oghje.
Classificazione cromatografica
L'essenza di a cromatografia hè un prucessu in quale e molécule da esse siparate sò spartuti è equilibrati trà a fase stazionaria è a fase mobile.Diversi sustanzi sò spartuti in modu diversu trà e duie fasi, chì li face muvimenti à diverse velocità cù a fase mobile.Cù u muvimentu di a fase mobile, diversi cumpunenti in a mistura sò siparati l'una di l'altru nantu à a fase stazionaria.Sicondu u mecanismu, pò esse divisu in una varietà di categurie.
1, secondu a classificazione di u statu fisicu in dui fasi
Fase mobile: cromatografia di gas, cromatografia liquida, cromatografia fluida supercritica
Fase stazionaria: gas-solidu, gas-liquidu;Liquidu-solidu, liquidu-liquidu
2, secondu a forma di classificazione fase stazionaria
Cromatografia in colonna: cromatografia in colonna imballata, cromatografia in colonna capillare, cromatografia in colonna micropacked, cromatografia preparativa
Cromatografia piana: cromatografia di carta, cromatografia di strati sottili, cromatografia di membrana polimerica
3, classificatu secondu u mecanismu di separazione
Cromatografia d'adsorzione: i diversi cumpunenti sò separati secondu e so capacità di adsorption è di desorption nantu à l'adsorbenti.
Cromatografia di partizione: I diversi cumpunenti sò separati secondu a so solubilità in u solvente
Cromatografia d'esclusione moleculare: secondu a dimensione di a dimensione moleculare di a separazione in cromatografia di scambiu di ioni: diverse cumpunenti di l'affinità per a separazione di resina di scambiu di ioni
Cromatografia d'affinità: Separazione utilizendu a presenza di una affinità specifica trà macromolecule biologiche
Elettroforesi capillare : i cumpunenti sò stati separati secondu e sferenze in a mobilità è / o cumportamentu di partizione
A cromatografia chirale hè aduprata per a separazione è l'analisi di droghe chirali, chì ponu esse divisu in trè categurie: metudu di reagenti di derivatizazione chirali;Metudu additivu di fase mobile chirale;Metudu di risoluzione di fase stazionaria chirale
Terminologia basica per a cromatografia
E curve ottenute tracciandu i signali di risposta di i cumpunenti dopu a rilevazione di a separazione cromatografica contru u tempu sò chjamati cromatogrammi.
Baseline:In certi cundizioni cromatografiche, a curva di u signale generatu quandu solu a fase mobile passa per u sistema di detector hè chjamata basa, cum'è mostra in a linea ot.Quandu a cundizione sperimentale era stabile, a linea di basa era una linea parallela à l'assi horizontale.A linea di basa riflette u rumore di l'instrumentu, principarmenti u detector, cù u tempu.
Altezza di punta:a distanza verticale trà u puntu piccu chromatographic è a linea di basa, denotata da h, cum'è mostra in u AB 'linea.
larghezza di a regione:A larghezza di a regione di u piccu cromatograficu hè direttamente ligata à l'efficienza di separazione.Ci sò trè metudi per descriverà a larghezza di u piccu cromatograficu: deviazione standard σ, larghezza di piccu W, è FWHM W1/2.
Déviation standard (σ) :σ hè a mità di distanza trà i dui punti d'inflessione nantu à a curva di distribuzione normale, è u valore di σ indica u gradu di dispersione di i cumpunenti luntanu da a colonna.Più grande hè u valore di σ, più dispersi i cumpunenti di l'effluente, è peghju l'effettu di separazione.À u cuntrariu, i cumpunenti effluent sò cuncentrati è l'effettu di separazione hè bonu.
Larghezza massima W:I punti di intersezzione in i dui lati di u piccu cromatograficu sò usati cum'è linee tangenti, è l'intersezzione nantu à a linea di basa hè chjamata larghezza di punta, o larghezza di basa, chì pò ancu esse espressa cum'è W, cum'è mostra in Figura IJ.Sicondu u principiu di distribuzione normale, a relazione trà a larghezza di u piccu è a deviazione standard pò esse pruvata à esse W = 4σ.
W1/2:A larghezza di u piccu à a mità di l'altezza di u piccu hè chjamatu FWHM, cum'è mostratu per a distanza di GH.W1/2=2,355σ, W=1,699W1/2.
W1/2, W sò tutti dui derivati da σ è sò usati per calculà e superfici di punta in più di misurà l'effettu di a colonna.A misurazione FWHM hè più cunvene è più comunmente utilizata.
brevi riassuntu
Da a curva di u piccu cromatograficu di u flussu di u flussu, i seguenti obiettivi ponu esse ottenuti:
a, L'analisi qualitativa hè stata fatta nantu à u valore di retenzioni di picchi cromatografici
b, analisi quantitative basatu annantu à l'area o piccu di u piccu cromatograficu
C. L'efficienza di separazione di a colonna hè stata evaluata secondu u valore di retenzioni è a larghezza di u piccu di u piccu cromatograficu.
A formula di calculu implicata in a cromatografia
1. Valore di retenzioni
U valore di retenzioni hè un paràmetru utilizatu per discrìviri u gradu à quale un cumpunente di mostra hè ritenutu in a colonna è hè utilizatu com'è un indicatore di carattarizazione cromatografica.U so metudu di rapprisintazioni hè a siguenti:
Tempu di ritenzione tR
Tempu di a mortetM
Aghjustate u tempu di ritenzione tR'=tR- tM
(Tempu tutale passatu in fase stazionaria)
Volume di ritenzione
VR=tR*F. (indipendente da a velocità di a fase mobile)
Volume mortu
VM=tM*Fc
(U spaziu micca occupatu da a fase stazionaria in u percorsu di flussu da l'iniettore à u detector)
Aghjustate u voluminu di ritenzione VR'= t'R* Fc
2. Valore di retenzioni relative
U valore di retenzioni relative, cunnisciutu ancu com'è fattore di separazione, ratio di coefficient di partizione o fattore di capacità relative, hè u rapportu di u tempu di ritenzione (volume) aghjustatu di u cumpunente testatu à u tempu di ritenzione (volume) di u standard in certi cundizioni cromatografiche.
I valori di retenzioni relative sò stati utilizati per eliminà l'influenza di certi cundizioni operativi, cum'è u flussu è a perdita fissativa, nantu à i valori di retenzioni.U standard in u valore di ritenzione relative pò esse un cumpunente in a mostra testata o un compostu aghjuntu artificialmente.
3. Indice di retenzioni
L'indici di retenzioni hè l'indici di retenzioni di a sustanza i per esse pruvatu in una suluzione fissa X. Dui n-alane sò scelti cum'è sustanzi di riferimentu, unu di quale hà N numeru di carbonu è l'altru hà N + n.U so tempu di ritenzione aghjustatu hè t 'r (N) è t 'r (N + n), rispettivamente, cusì chì u tempu di ritenzione aghjustatu t'r (i) di a sustanza i da pruvà hè esattamente trà elli, vale à dì, t'r (N).
L'indice di retenzioni pò esse calculatu cum'è seguitu.
4. Fattore di capacità (k)
À l'equilibriu, u rapportu di a massa di un cumpunente in a fase stazionaria (s) à a fase mobile (m), chjamatu factor di capacità.A formula hè a siguenti:
5 、 Coefficient di partizione (K) In equilibriu, u rapportu di a cuncentrazione di un cumpunente in a fase stazionaria (s) à a fase mobile (m), chjamatu coefficient di spartizione.A formula hè a siguenti
A relazione trà K è k:
Si riflette u tippu di culonna è u so nodo proprietà impurtanti di struttura
brevi riassuntu
Relazione trà u valore di ritenzione è u fattore di capacità è u coefficient di partizione:
A separazione cromatografica hè basatu annantu à a diffarenza in a capacità di adsorption o dissoluzione di ogni cumpunente in una mostra relativa fissa, chì pò esse espressa quantitativamente da a dimensione di u valore di u coefficient di partizione K (o factor di capacità k).
I cumpunenti cù una forte capacità di adsorption o dissoluzione anu un grande coefficient di partizione (o fattore di capacità) è un longu tempu di retenzione.À u cuntrariu, i cumpunenti cù adsorption debule o solubilità anu un picculu coefficient di spartizione è un cortu tempu di retenzione.
Teoria basica di a cromatografia
1. Teoria di vassoi
(1) Mettite avanti - teoria termodinamica
Hè cuminciatu cù u mudellu di piastra di torre pruposta da Martin è Synge.
Colonna di fraccionamentu: in a tavula per parechje volte di equilibriu gasu-liquidu, secondu u puntu di ebollizione di a separazione differente.
Colonna: I cumpunenti sò equilibrati da parechje partizioni trà e duie fasi è siparati secondu diversi coefficienti di spartizione.
(2) Iputesi
(1) Ci sò parechje bande in a colonna, è i cumpunenti ponu ghjunghje rapidamente à l'equilibriu di distribuzione in l'intervallu di a bande (vale à dì, l'altezza di a bandeja).
(2) A fase mobile entra in a colonna, micca continuamente, ma pulsating, vale à dì, ogni passaghju hè un voluminu di colonna.
(3) Quandu a mostra hè stata aghjunta à ogni platu di colonna, a diffusione di a mostra nantu à l'assi di a colonna puderia esse trascurata.
(4) U coefficient di spartizione hè uguali in tutti i vassoi, indipendentemente da a quantità di cumpunenti.Vale à dì, u coefficient di spartizione hè custante nantu à ogni taban.
(3) Principiu
Schema schematicu di a teoria di u vasu
Sì un cumpunente di unità di massa, vale à dì m = 1 (per esempiu, 1mg o 1μg), hè aghjuntu à a tavula N ° 0, è dopu l'equilibriu di distribuzione, perchè k = 1, vale à dì ns = nm, nm = ns = 0,5.
Quandu un vulume di piastra (lΔV) di u gasu trasportatore entra in a piastra 0 in forma di pulsazione, u gasu trasportatore chì cuntene u cumpunente nm in a fase di gasu hè imbuttatu à a piastra 1. À questu tempu, u cumpunente ns in a fase liquida di a piastra 0 è u cumpunente nm in a fase di gasu di a piastra 1 serà ridistribuitu trà e duie fasi.Per quessa, a quantità tutale di cumpunenti cuntenuti in a piastra 0 hè 0,5, in quale e fasi di gasu è di liquidu sò ogni 0,25, è a quantità totale di u pianu 1 hè ancu 0,5.E fasi di gasu è liquidu eranu ancu 0,25.
Stu prucessu hè ripetutu ogni volta chì un novu gasu trasportatore di u voluminu di piastra hè pulsatu in a colonna (vede a tavola sottu).
(4) Equazione di a curva di flussu cromatografica
σ hè a deviazione standard, hè u tempu di ritenzione, C hè a concentrazione in ogni mumentu,
C, hè a cuncentrazione di l'iniezione, vale à dì a quantità tutale di cumpunenti (area di punta A).
(5) paràmetri efficienza colonna
À un tR constantu, u più chjucu W o w 1/2 (vale à dì, u piccu più strettu), u più grande u numeru di platti teorichi n, u più chjucu l'altitudine di u pianu teoricu, è più altu l'efficienza di separazione di a colonna.U stessu hè veru di a teoria efficace neff tray.Per quessa, u numeru teoricu di tavulini hè un indice per evaluà l'efficienza di e culonne.
(5)Caratteristiche è difetti
> Vantaggi
A teoria di vassoi hè semi-empirica è spiega a forma di a curva di u flussu
I prucessi di partizione è separazione di i cumpunenti sò illustrati
Un indice per evaluà l'efficienza di a colonna hè prupostu
> Limitazioni
I cumpunenti ùn ponu micca veramente ghjunghje à l'equilibriu di distribuzione in e duie fasi:
A diffusione longitudinale di cumpunenti in a colonna ùn pò esse ignorata:
L'influenza di diversi fatturi cinetichi nantu à u prucessu di trasferimentu di massa ùn hè micca cunsideratu.
A relazione trà l'effettu di a colonna è a velocità di flussu di a fase mobile ùn pò esse spiegata:
Ùn hè micca chjaru chì fatturi principali affettanu l'effettu di a colonna
Questi prublemi sò risolti satisfactoriamente in a teoria di a tarifa.
2. Teoria di a tarifa
In u 1956, u studiu olandese VanDeemter et al.assurbutu u cuncettu di teoria di vassoi, è cumminatu i fatturi cinetichi chì affettanu l'altitudine di a tavola, pruposti a teoria cinetica di u prucessu cromatograficu - a teoria di a tarifa, è hà derivatu l'equazioni VanDeemter.Cunsidereghja u prucessu cromatograficu cum'è un prucessu dinamicu senza equilibriu è studia l'influenza di i fatturi cinetici nantu à l'allargamentu di u piccu (vale à dì, l'effettu di a colonna).
Più tardi, Giddings è Snyder et al.pruposti l 'equazzioni tasso di cromatografia liquidu (vale à dì equazzioni Giddings) basatu supra l 'equazzioni VanDeemter (più tardi chiamatu l' equazzioni tassi di cromatografia di gas) è secondu a diferenza di pruprietà trà liquidu è gasu.
(1) Equazioni di Van Deemter
Induve: H: hè l'altezza di u tavulinu
A: coefficient di eddy diffusion term
B: coefficient di terminu di diffusione moleculare
C : coefficient di u termu di resistenza di trasferimentu di massa
(2) Equazioni di Giddings
Analisi quantitativa è qualitativa
(1) Analisi qualitativa
L'analisi cromatografica qualitativa hè di determinà i composti rapprisentati da ogni piccu cromatograficu.Siccomu diverse sustanzi anu valori di ritenzione definiti in certi cundizioni cromatografichi, u valore di retenzioni pò esse usatu cum'è un indice qualitatiu.Diversi metudi qualitativi cromatografichi sò attualmente basati nantu à i valori di retenzioni.
Tuttavia, sustanzi diffirenti ponu avè valori di retenzioni simili o idèntici in e stesse cundizioni cromatografiche, vale à dì, i valori di retenzioni ùn sò micca esclusivi.Cusì hè difficiule di caratterizà una mostra cumplitamenti scunnisciuta basatu solu nantu à i valori di retenzioni.Se nantu à a basa di capiscenu a fonte, a natura è u scopu di a mostra, un ghjudiziu preliminare di a cumpusizioni di a mostra pò esse fatta, è i seguenti metudi ponu esse usatu per determinà u compostu rapprisintatu da u piccu cromatograficu.
1. Cuntrolla qualitativa cù sustanzi puri
In certi cundizioni cromatografiche, un scunnisciutu hà solu un tempu di ritenzione definitu.Dunque, u scunnisciutu pò esse identificatu qualitativamente paragunendu u tempu di ritenzione di a sustanza pura cunnisciuta in e stesse cundizioni cromatografiche cù u tempu di ritenzione di a sustanza scunnisciutu.Sì i dui sò listessi, a sustanza scunnisciuta pò esse una sustanza pura cunnisciuta;Altrimenti, u scunnisciutu ùn hè micca a sustanza pura.
U metudu di cuntrollu di sustanza pura hè applicabile solu à a sustanza scunnisciuta chì a so cumpusizioni hè stata cunnisciuta, a so cumpusizioni hè relativamente simplice è a so sustanza pura hè cunnisciuta.
2. Metudu di valore di ritenzione relative
La valeur de rétention relative α, se réfère à l'ajustement entre le composant i et les matériaux de référence Rapport des valeurs de rétention :
Cambia solu cù u cambiamentu di a temperatura di fissazione è di a colonna, è ùn hà nunda di fà cù altre cundizioni operative.
À una certa fase stazionaria è a temperatura di a colonna, i valori di ritenzione aghjustati di u cumpunente i è a sustanza di riferimentu s sò misurati rispettivamente, è dopu calculati secondu a formula sopra.I valori di retenzioni relative ottenuti ponu esse paragunati qualitativamente cù i valori currispondenti in a literatura.
3, aghjunghjendu sustanzi cunnisciuti per aumentà u metudu di l'altitudine di punta
Quandu ci sò parechji cumpunenti in u campionu scunnisciutu, i picchi cromatografici ottenuti sò troppu densi per esse facilmente identificati da u metudu di sopra, o quandu u campione scunnisciutu hè solu utilizatu per l'analisi di l'articuli specificati.
"Prima hè fattu un cromatogramma di una mostra scunnisciuta, è dopu un cromatogramma supplementu hè ottenutu aghjustendu una sustanza cunnisciuta à a mostra scunnisciuta".I cumpunenti cù l'altitudine di piccu aumentati ponu esse cunnisciuti per tali sustanzi.
4. Mantene u metudu qualitativu di l'indici
L'indice di ritenzione rapprisenta u cumpurtamentu di ritenzione di sustanzi nantu à i fissativi è hè attualmente l'indice qualitatiu più utilizatu è ricunnisciutu internaziunale in GC.Havi i vantaghji di una bona riproducibilità, un standard uniforme è un coefficient di temperatura chjucu.
L'indice di ritenzione hè solu ligatu à e proprietà di a fase stazionaria è a temperatura di a colonna, ma micca à altre cundizioni sperimentali.A so precisione è riproducibilità sò eccellenti.Sempre chì a temperatura di a colonna hè uguale à quella di a fase stazionaria, u valore di a literatura pò esse appiicata per l'identificazione, è ùn hè micca necessariu d'utilizà u materiale puro per paragunà.
(2) Analisi quantitativa
Basi per a quantificazione cromatografica:
U compitu di l'analisi quantitativa hè di truvà u centu di i cumpunenti in a mostra mista
Cuntinutu fraccionari.A quantificazione cromatografica hè stata basata nantu à i seguenti: quandu e cundizioni di u funziunamentu eranu cunsistenti, era
A massa (o cuncentrazione) di u cumpunente misuratu hè determinata da u signale di risposta datu da u detector
Hè proporzionale.Vale à dì:
Basi per a quantificazione cromatografica:
U compitu di l'analisi quantitativa hè di truvà u centu di i cumpunenti in a mostra mista
Cuntinutu fraccionari.A quantificazione cromatografica hè stata basata nantu à i seguenti: quandu e cundizioni di u funziunamentu eranu cunsistenti, era
A massa (o cuncentrazione) di u cumpunente misuratu hè determinata da u signale di risposta datu da u detector
Hè proporzionale.Vale à dì:
1. Metudu di misurazione di l'area di punta
L'area di piccu hè a dati quantitativi basi furniti da i cromatogrammi, è l'accuratezza di a misurazione di l'area di piccu influenza direttamente i risultati quantitativi.Diversi metudi di misurazione sò stati utilizati per i picchi cromatografichi cù diverse forme di picchi.
Hè difficiuli di truvà u valore esatta di l'invernu in l'analisi quantitativa:
Da un latu, per via di a difficultà di misurà accuratamente u voluminu di iniezione assoluta: da l'altra banda
L'area di piccu dipende da e cundizioni cromatografiche, è a striscia cromatografica deve esse mantenuta quandu u valore hè misuratu.
Ùn hè nè pussibule nè cunvene per fà a listessa cosa.È ancu s'ellu pudete piglià bè
U valore esatta, ancu perchè ùn ci hè micca un standard unificatu è ùn pò micca esse direttamente appiicatu.
2.Quantitative currezzione fattore
Definizione di fattore di correzione quantitativa: quantità di cumpunenti chì entranu in u detector (m)
U rapportu di a so area di piccu cromatograficu (A) o l'altezza di u piccu () hè una constante di proporzionalità (,
A constante di proporzionalità hè chjamata u fattore di correzione assoluta per u cumpunente.
Hè difficiuli di truvà u valore esatta di l'invernu in l'analisi quantitativa:
Da un latu, per via di a difficultà di misurà accuratamente u voluminu di iniezione assoluta: da l'altra banda
L'area di piccu dipende da e cundizioni cromatografiche, è a striscia cromatografica deve esse mantenuta quandu u valore hè misuratu.
Ùn hè nè pussibule nè cunvene per fà a listessa cosa.È ancu s'ellu pudete piglià bè
U valore esatta, ancu perchè ùn ci hè micca un standard unificatu è ùn pò micca esse direttamente appiicatu.
Vale à dì, u fattore di currezzione relative 'di un cumpunente hè u cumpunente è u materiale di riferimentu s
U rapportu di i fatturi di correzione assoluta.
Pò esse vistu chì u fattore di correzione relative hè quandu a qualità di u cumpunente versus u standard.
Quandu a sustanza s hè uguali, l'area di punta di u materiale di riferimentu hè a zona di punta di u cumpunente
Multiple.Se qualchì cumpunente hà massa m è area di piccu A, allora u numeru di f'A
I valori sò uguali à l'area di punta di u materiale di riferimentu cù massa di.In altre parolle,
Per mezu di u fattore di currezzione relative, i zoni di punta di ogni cumpunente ponu esse separati
Cunvertite à l'area di u piccu di u materiale di riferimentu uguali à a so massa, dopu u rapportu
U standard hè unificatu.Allora questu hè u metudu nurmalizatu per calculà u percentuale di ogni cumpunente
A basa di quantità.
Metudu di ottene un fattore di correzione relative: i valori di u fattore di correzione relative sò stati paragunati solu cù esse
A misurazione hè ligata à u standard è u tipu di detector, ma à a striscia di operazione
Ùn importa micca.Dunque, i valori ponu esse recuperati da e referenze in a literatura.Se u testu
Se ùn pudete micca truvà u valore desideratu in l'offerta, pudete ancu stabilisce da sè stessu.Metudu di determinazione
Metudu: Una certa quantità di a sustanza misurata dece materiale di riferimentu sceltu → fattu in una certa cuncentrazione
I picchi cromatografici A è As di i dui cumpunenti sò stati misurati.
Eccu a formula.
3. Metudu càlculu quantitative
(1) Metudu di nurmalizazione di l'area
A summa di u cuntenutu di tutte e frazioni senza piccu hè stata calculata cum'è 100% per a quantificazione.
U metudu hè chjamatu nurmalizazione.A so formula di calculu hè a siguenti:
Induve P,% hè u cuntenutu percentuale di i cumpunenti pruvati;A1, A2... A n hè cumpunente 1. L'area di piccu di 1 ~ n;f'1, f'2... f'n hè u fattore di currezzione relative per i cumpunenti da 1 à n.
(2) mètudu standard esternu
U metudu di paraguni quantitativi trà u signale di risposta di u cumpunente per esse pruvatu in a mostra è u cumpunente puru per esse pruvatu cum'è u cuntrollu.
(3) Metudu standard internu
U cosiddettu metudu standard internu hè un metudu in u quale una certa quantità di sustanza pura hè aghjuntu à a suluzione standard di a sustanza testata è a suluzione di mostra cum'è un standard internu, è dopu analizatu è determinatu.
(3) metudu di aghjuntu standard
U metudu di l'aghjunzione standard, cunnisciutu ancu u metudu di l'aghjuntu internu, hè di aghjunghje una certa quantità di (△C)
A riferenza di a sustanza di prova hè stata aghjunta à a suluzione di mostra per esse pruvatu, è a prova hè stata aghjunta à l'assay
U piccu di a suluzione di mostra dopu a sustanza era più altu ch'è quellu di a suluzione di mostra originale
L'incrementu di l'area (△A) hè stata utilizata per calculà a cuncentrazione di a sustanza in a suluzione di mostra
Cuntenutu (Cx)
Induve Ax hè l'area di punta di a sustanza per esse misurata in u campione originale.
Tempu di post: 27-mar-2023