Principi è Metudi di Analisi Quantitativa da Cromatografia Liquida

U mecanismu di separazione di a cromatografia liquida hè basatu annantu à a diffarenza di l'affinità di i cumpunenti in a mistura per e duie fasi.

Sicondu e diverse fasi stazionarie, a cromatografia liquida hè divisa in cromatografia liquidu-solidu, cromatografia liquidu-liquidu è cromatografia in fase ligata.I più utilizati sò a cromatografia liquidu-solida cù gel di silice cum'è riempimentu è a cromatografia in fase ligata cù microsilica cum'è matrice.

Sicondu a forma di fase stazionaria, a cromatografia liquida pò esse divisa in cromatografia di colonna, cromatografia di carta è cromatografia di strati sottili.Sicondu a capacità di adsorption, pò esse divisu in cromatografia di adsorption, cromatografia di partizione, cromatografia di scambiu di ioni è cromatografia di permeazione di gel.

Nta l'ultimi anni, un sistema di flussu di liquidu d'alta pressione hè statu aghjuntu à u sistema di cromatografia di colonna di liquidu per fà u flussu di fase mobile rapidamente sottu pressione alta per migliurà l'effettu di separazione, cusì cromatografia liquida d'alta efficienza (cunnisciutu ancu com'è alta pressione). hè apparsu.

PART
01 Principiu di Analisi Quantitative di Cromatografia Liquida

Per quantificà nantu à a basa di qualità, sustanzi puri sò necessarii cum'è standard;

A quantificazione di cromatografia liquida hè un metudu relativamente quantitatu: vale à dì, a quantità di l'analita in a mistura hè stimata da una quantità cunnisciuta di mostra standard pura.

PART
02 Basi per a Quantificazione per Cromatografia Liquida

A quantità di u cumpunente misuratu (W) hè proporzionale à u valore di risposta (A) (altitudine di piccu o area di piccu), W = f × A.

Fattore di currezzione quantitativa (f): Hè a custante di proporzionalità di a formula di calcul quantitativa, è u so significatu fisicu hè a quantità di u cumpunente misuratu rapprisintatu da u valore di risposta unità (area di punta).

U fattore di correzione quantitativa pò esse acquistatu da a quantità cunnisciuta di mostra standard è u so valore di risposta.

Misura u valore di risposta di u cumpunente scunnisciutu, è a quantità di u cumpunente pò esse ottenuta da u fattore di correzione quantitativa.

PART
03 Termini cumuni in l'analisi quantitativa

Sample (sample) : una suluzione chì cuntene un analita per l'analisi cromatografica.Divisu in campioni standard è scunnisciuti.

Standard: Un pruduttu puru cun una cuncentrazione cunnisciuta.Campione scunnisciutu (sconnu): A mistura chì a cuncentrazione deve esse pruvata.

Pesu di campionu: U pesu originale di a mostra per esse pruvata.

Dilution: u fattore di diluzione di a mostra scunnisciuta.

Cumpunente : u piccu cromatograficu da analizà quantitativamente, vale à dì l'analite chì u so cuntenutu hè scunnisciutu.

A quantità di cumpunenti (quantità): u cuntenutu (o cuncentrazione) di a sustanza da pruvà.

Integerità : U prucessu computazionale di misurà l'area di u piccu di un piccu cromatograficu da un computer.

Curva di calibrazione: Una curva lineale di cuntenutu di cumpunenti versus valore di risposta, stabilita da una quantità cunnisciuta di sustanza standard, utilizata per determinà u cuntenutu scunnisciutu di l'analita.

PART
04 Analisi quantitativa di cromatografia liquida

1. Selezziunate un metudu cromatograficu adattatu per l'analisi quantitativa:

l Cunfirmà u piccu di u cumpunente rilevatu è ottene una risoluzione (R) più grande di 1,5

l Determinà a cunsistenza (purità) di i picchi cromatografici di i cumpunenti pruvati

l Determinà u limitu di deteczione è u limitu di quantificazione di u metudu;sensibilità è gamma lineare

2. Stabbilisce una curva di calibrazione cù campioni standard di diverse concentrazioni

3. Verificate l'accuratezza è a precisione di i metudi quantitativi

4. Aduprate u software di gestione di cromatografia currispundente per implementà a cullizzioni di mostra, u trattamentu di dati è i risultati di rapportu

PART
05 Identificazione di picchi quantitativi (qualitativi)

Identificà qualitativamente ogni piccu cromatograficu da quantificà

Prima, utilizate a mostra standard per determinà u tempu di ritenzione (Rt) di u piccu cromatograficu per esse quantificatu.Paragunendu u tempu di ritenzione, truvate u cumpunente currispundenti à ogni piccu cromatograficu in a mostra scunnisciuta.U metudu qualitativu cromatograficu hè di paragunà u tempu di ritenzione cù a mostra standard.U criteriu Insufficienteulteriore cunferma (qualitativa)

1. Metudu di aghjuntu standard

2. Aduprà altri metudi à u stessu tempu: altri metudi cromatografichi (cambià u miccanisimu, cum'è: utilizendu diverse colonne cromatografiche), altri detectors (PDA: paraguni di spettru, ricerca di biblioteca di spettru; MS: analisi di spettru di massa, ricerca di biblioteca di spettru)

3. Altri strumenti è metudi

PART
06 Cunfirmazione di u Peak Consistency Quantitative

Cunfirmà a cunsistenza di u piccu cromatograficu (purità)

Assicuratevi chì ci hè solu un cumpunente misuratu sottu à ogni piccu cromatograficu

Verificate l'interferenza da sustanzi coeluting (impurità)

Metudu per a cunferma di a cunsistenza di u piccu cromatograficu (purità)

Comparazione di spettrogrammi cù rilevatori di matrice di fotodiodi (PDA).

Identificazione di a purezza massima

2996 Teoria di l'Angle di Purità

I metudi quantitativi cumunimenti usati in a PART 07

Metudu di curva standard, divisu in u metudu standard esternu è u metudu standard internu:

1. Metudu standard esternu: u più usatu in cromatografia liquida

Una seria di campioni standard di cuncentrazione cunnisciuta sò stati preparati utilizendu campioni puri di i composti per esse pruvati cum'è campioni standard.injected in a colonna finu à u so valore di risposta (area di piccu).
In un certu intervallu, ci hè una bona relazione lineale trà a cuncentrazione di u campione standard è u valore di risposta, vale à dì W = f × A , è una curva standard hè fatta.

Sottu à e stesse cundizioni sperimentali, iniettate u campione scunnisciutu per ottene u valore di risposta di u cumpunente per esse misuratu.Sicondu u coefficient cunnisciutu f , a cuncentrazione di u cumpunente per esse misurata pò esse ottenuta.

I vantaghji di u metudu standard esternu:funziunamentu simplice è calculu, hè un metudu quantitatiu cumunimenti usatu;ùn hè micca bisognu di ogni cumpunente per esse rilevatu è elutatu;campione standard hè necessariu;e cundizioni di misurazione di mostra standard è campionu scunnisciutu deve esse coherente;u voluminu di iniezione deve esse precisa.

Svantaghji di u metudu standard esternu:E cundizioni sperimentali sò richiesti à esse altu, cum'è a sensibilità di u detector, u flussu di flussu, è a cumpusizioni di a fase mobile ùn pò esse cambiata;u voluminu di ogni iniezione deve avè una bona ripetibilità.

2. Metudu standard internu: precisu, ma fastidiosu, più utilizatu in i metudi standard

Una quantità cunnisciuta di u standard internu hè aghjuntu à u standard per fà un standard mistu, è una serie di standard di travagliu di cuncentrazione cunnisciuta sò preparati.U rapportu molare di u standard à u standard internu in u standard mistu resta invariatu.Inject in a colonna cromatografica è pigliate (zona di punta di campione standard / area di punta di campione standard internu) cum'è u valore di risposta.Sicondu a relazione lineale trà u valore di risposta è a cuncentrazione di u standard di travagliu, vale à dì W = f × A , hè fatta una curva standard.

Una quantità cunnisciuta di standard internu hè aghjuntu à u campione scunnisciutu è injected in a colonna per ottene u valore di risposta di u cumpunente per esse misuratu.Sicondu u coefficient cunnisciutu f , a cuncentrazione di u cumpunente per esse misurata pò esse ottenuta.

E caratteristiche di u metudu standard internu:Durante l'operazione, u campione è u standard internu sò mischiati inseme è injected in a colonna cromatografica, finu à chì u rapportu di a quantità di u cumpunente misuratu à u standard internu in a suluzione mista hè constante, u cambiamentu di u voluminu di mostra. ùn affetterà micca i risultati quantitativi..U metudu standard internu compensa l'influenza di u voluminu di mostra, è ancu a fase mobile è u detector, cusì hè più precisu chè u metudu standard esternu.

PART
08 Fattori chì affettanu i risultati di l'analisi quantitativa

A poca precisione pò esse causata da:

Integrazione incorretta di l'area di punta, decomposizione di campionu o impurità introdutte durante a preparazione di campioni, vial di campionu micca sigillatu, volatilizazione di campioni o solventi, preparazione incorrecta di campioni, prublemi di iniezione di campioni, preparazione standard interna incorrecta

Possibili ragioni per a poca precisione:

Integrazione di picchi incorrette, prublemi di iniezione o iniettore, decomposizione di campionu o impurità introdutte durante a preparazione di campioni, prublemi cromatografichi, risposta di detector degradata