A cromatografia liquida hè u metudu principalu per pruvà u cuntenutu di ogni cumpunente è impurità in materie prime, intermedi, preparazione è materiali di imballaggio, ma assai sustanzi ùn anu micca metudi standard per s'appoghjanu, cusì hè inevitabbile di sviluppà novi metudi. In u sviluppu di i metudi di fase di liquidu, a colonna cromatografica hè u core di a cromatografia liquida, per quessa, cumu sceglie una colonna cromatografica adattata hè cruciale. In questu articulu, l'autore spiegherà cumu sceglie una colonna di cromatografia liquida da trè aspetti: idee generale, considerazioni è scopu di l'applicazione.
A.Idei generali per selezziunà e colonne di cromatografia liquida
1. Evaluate e proprietà fisiche è chimiche di l'analyte: cum'è a struttura chimica, a solubilità, a stabilità (per esempiu s'ellu hè faciule d'ossidatu / ridottu / idrolizatu), l'acidità è l'alcalinità, etc., in particulare a struttura chimica hè a chjave. fattore in a determinazione di e proprietà, cum'è u gruppu cunjugatu hà una forte absorption ultraviolet è una forte fluoriscenza;
2. Determinà u scopu di l'analisi: s'ellu hè necessariu una alta separazione, una alta efficienza di colonna, un cortu tempu d'analisi, una sensibilità alta, una resistenza à alta pressione, una longa vita di colonna, un costu bassu, etc.
- Sceglite una colonna cromatografica adatta: capisce a cumpusizioni, e proprietà fisiche è chimiche di u filler cromatograficu, cum'è a dimensione di particella, a dimensione di i pori, a tolleranza di a temperatura, a tolleranza di pH, l'adsorzione di l'analita, etc.
- Considerazioni per a selezzione di e colonne di cromatografia liquida
Stu capitulu discuterà i fatturi chì deve esse cunsideratu quandu selezziunate una colonna di cromatografia da a perspettiva di e proprietà fisiche è chimiche di a colonna di cromatografia stessu. 2.1 Matrice di riempimentu
2.1.1 Matrice di gel di silice A matrice di riempimentu di a maiò parte di e colonne di cromatografia liquida hè gel di silice. Stu tipu di riempimentu hà una purezza elevata, un prezzu bassu, una forza meccanica alta, è hè faciule di mudificà gruppi (cum'è ligame fenile, ligame amminicu, ligame ciano, etc.), ma u valore di pH è a gamma di temperatura chì tollerà sò limitati: A gamma di pH di a maiò parte di i filler di matrice di gel di silice hè da 2 à 8, ma a gamma di pH di fasi ligate di gel di silice modificate in particulare pò esse larga da 1,5 à 10, è ci sò ancu fasi ligate di gel di silice modificati chì sò stabili à pH bassu. cum'è Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, chì hè stabile à pH 1 à 8; U limitu di temperatura superiore di a matrice di gel di silice hè di solitu 60 ℃, è alcune colonne di cromatografia ponu tollerà una temperatura di 40 ℃ à pH altu.
2.1.2 Matrice di polimeru I carichi di polimeru sò principalmente polistirene-divinilbenzene o polimetacrilate. I so vantaghji sò chì ponu tollerà una larga gamma di pH - ponu esse aduprate in a gamma di 1 à 14, è sò più resistenti à l'altitudine temperature (pò ghjunghje sopra à 80 ° C). In cunfrontu cù i filler C18 basati in silice, stu tipu di riempimentu hà una idrofobicità più forte, è u polimeru macroporoso hè assai efficace in a separazione di campioni cum'è e proteine. I so svantaghji sò chì l'efficienza di a colonna hè più bassu è a forza meccanica hè più debule di quella di i filler basati in silice. 2.2 Forma di particella
A maiò parte di i filler HPLC muderni sò particeddi sferichi, ma à volte sò particelle irregulari. I particeddi sferichi ponu furnisce una pressione di colonna più bassa, una efficienza di colonna più alta, stabilità è una vita più longa; quandu usu di fasi mobile high-viscosity (cum'è l'acidu fosforicu) o quandu a suluzione di mostra hè viscosa, particeddi irregulari anu una superficia specifica più grande, chì hè più favurevule à l'azzione piena di e duie fasi, è u prezzu hè relativamente bassu. 2.3 Grandezza di particella
A più chjuca hè a dimensione di particella, u più altu l'efficienza di a colonna è a più alta a separazione, ma u peghju hè a resistenza à l'alta pressione. A colonna più comunmente utilizata hè a colonna di particella di 5 μm; se u requisitu di separazione hè altu, pò esse sceltu un filler di 1,5-3 μm, chì aiuta à risolve u prublema di separazione di qualchi matrice cumplessa è campioni multi-cumpunenti. UPLC pò aduprà 1,5 μm di riempimentu; 10 μm o filler di particella più grande sò spessu usati per e colonne semi-preparative o preparative. 2.4 U cuntenutu di carbone
U cuntenutu di carbone si riferisce à a proporzione di fasi ligate nantu à a superficia di u gel di silice, chì hè in relazione cù a superficia specifica è a copertura di a fase ligata. U cuntenutu altu di carbone furnisce una capacità di colonna alta è una alta risoluzione, è hè spessu usata per campioni cumplessi chì necessitanu una alta separazione, ma per via di u tempu d'interazzione longu trà e duie fasi, u tempu d'analisi hè longu; I culonni cromatografici di cuntenutu di carbonu bassu anu un tempu d'analisi più brevi è ponu vede diverse selettività, è sò spessu usati per campioni simplici chì necessitanu analisi rapida è campioni chì necessitanu cundizioni di fase aquosa alta. In generale, u cuntenutu di carbone di C18 varieghja da 7% à 19%. 2.5 Dimensione di poru è superficia specifica
I media di adsorption HPLC sò particeddi porosi, è a maiò parte di l'interazzione sò in i pori. Dunque, e molécule devenu entre in i pori per esse adsorbite è siparate.
A dimensione di i pori è a superficia specifica sò dui cuncetti cumplementarii. Small pore size significa grande superficie specifica, è vice versa. Una grande superficie specifica pò aumentà l'interazzione trà e molécule di mostra è fasi ligate, rinfurzà a ritenzione, aumentà a carica di mostra è a capacità di a colonna, è a separazione di cumpunenti cumplessi. Fillers cumpletamente porosi appartenenu à stu tipu di riempimentu. Per quelli chì anu un altu requisitu di separazione, hè cunsigliatu di sceglie filler cù una grande superficie specifica; una piccula superficia specifica pò riduce a pressione posteriore, migliurà l'efficienza di a colonna, è riduce u tempu d'equilibriu, chì hè adattatu per l'analisi di gradiente. I fillers Core-shell appartenenu à stu tipu di fillers. Nantu à a premessa di assicurà a separazione, hè cunsigliatu di sceglie filler cù una piccula superficia specifica per quelli chì anu esigenze di efficienza d'analisi elevata. 2.6 U voluminu di pori è forza meccanica
U voluminu di poru, cunnisciutu ancu "volume di poru", si riferisce à a dimensione di u voluminu di u vacu per particella unità. Pò riflette bè a forza meccanica di u filler. A forza meccanica di i filler cù un grande voluminu di poru hè ligeramente più debule di quellu di i fillers cù un picculu voluminu di poru. I fillers cù u voluminu di poru menu o uguali à 1,5 mL / g sò principalmente usati per a separazione HPLC, mentre chì i riempitivi cù u voluminu di poru più grande di 1,5 mL / g sò principalmente usati per a cromatografia d'esclusione moleculare è a cromatografia di bassa pressione. 2.7 Tasso di capping
A capping pò riduce i picchi di tailing causati da l'interazzione trà i composti è i gruppi di silanol esposti (cum'è u ligame ionicu trà composti alkalini è gruppi silanoli, forze di van der Waals è ligami d'idrogenu trà composti acidi è gruppi silanoli), per quessa, migliurà l'efficienza di a colonna è a forma di piccu. . E fasi ligate senza cappucciu pruduceranu selettività differenti relative à fasi ligate capped, in particulare per i campioni polari.
- Scopu di l'applicazione di diverse colonne di cromatografia liquida
Stu capitulu descriverà u scopu di l'applicazione di diversi tipi di colonne di cromatografia liquida in certi casi.
3.1 Colonna cromatografica C18 in fase inversa
A colonna C18 hè a colonna di fase inversa più cumunitamenti usata, chì pò scuntrà i testi di cuntenutu è impurità di a maiò parte di sustanzi organici, è hè appiicata à sustanzi polari medium, debbuli polari è non polari. U tipu è a specificazione di a colonna cromatografica C18 deve esse selezziunata secondu i requisiti di separazione specifichi. Per esempiu, per i sustanzi cù esigenze elevate di separazione, 5 μm * 4.6 mm * 250 mm specificazioni sò spessu usati; per sustanzi cù matrici di separazione cumplessu è polarità simili, 4 μm * 4.6 mm * 250 mm specificazioni o dimensioni di particella più chjuche ponu esse usate. Per esempiu, l'autore hà utilizatu una colonna di 3 μm * 4.6 mm * 250 mm per detectà duie impurità genotossiche in celecoxib API. A separazione di i dui sustanzi pò ghjunghje à 2,9, chì hè eccellente. Inoltre, sottu a premessa di assicurà a separazione, se l'analisi rapida hè necessariu, una culonna curta di 10 mm o 15 mm hè spessu scelta. Per esempiu, quandu l'autore hà utilizatu LC-MS / MS per detectà una impurità genotossica in l'API di fosfatatu di piperaquina, hè stata aduprata una colonna di 3 μm * 2.1 mm * 100 mm. A separazione trà l'impurità è u cumpunente principale era 2.0, è a rilevazione di una mostra pò esse cumpletata in 5 minuti. 3.2 Colonna di fenile in fase inversa
A colonna di fenile hè ancu un tipu di colonna in fase inversa. Stu tipu di colonna hà una forte selettività per i composti aromatichi. Se a risposta di i cumposti aromatichi misurati da a colonna C18 ordinaria hè debule, pudete cunsiderà rimpiazzà a colonna di fenile. Per esempiu, quandu facia celecoxib API, a risposta di cumpunenti principali misurata da a colonna di fenile di u stessu fabricatore è a stessa specificazione (tutti 5 μm * 4.6 mm * 250 mm) era circa 7 volte quella di a colonna C18. 3.3 Colonna di fase normale
Cum'è un supplementu efficace à a colonna di fase inversa, a colonna di fase normale hè adattata per composti altamente polari. Se u piccu hè sempre assai veloce quandu l'eluzione cù più di 90% di a fase aquosa in a colonna di fase inversa, è ancu vicinu à u piccu di solvente, pudete cunsiderà rimpiazzà a colonna di fase normale. Stu tipu di colonna include colonna hilica, colonna amino, colonna ciano, etc.
3.3.1 Colonna ilica La colonna ilica generalmente incorpora gruppi idrofili nella catena alchilica legata per migliorare la risposta alle sostanze polari. Stu tipu di colonna hè adattatu per l'analisi di sustanzi di zuccaru. L'autore hà utilizatu stu tipu di colonna quandu facia u cuntenutu è i sustanzi rilativi di xylose è i so derivati. L'isomeri di un derivativu di xilosa ponu ancu esse ben separati;
3.3.2 Colonna amino è colonna ciano A colonna amino è a colonna ciano si riferiscenu à l'intruduzioni di mudificazioni amino è ciano à a fine di a catena alchilica ligata, rispettivamente, per migliurà a selettività per sustanzi speciali: per esempiu, a colonna amino hè una bona scelta. per a separazione di zuccheri, aminoacidi, basi è amidi; A colonna ciano hà una selettività megliu quandu si separanu sustanzi strutturali simili idrogenati è unhydrogenati per via di a prisenza di ligami cunjugati. A colonna amino è a colonna ciano pò esse spessu cambiate trà a colonna di fase normale è a colonna di fase inversa, ma ùn hè micca cunsigliatu di cambià frequente. 3.4 Colonna chirale
A colonna chirali, cum'è u nome suggerisce, hè adattatu per a separazione è l'analisi di cumposti chirali, in particulare in u campu di i farmaci. Stu tipu di colonna pò esse cunsideratu quandu a fase inversa convenzionale è e culonne di fase normale ùn ponu micca ottene a separazione di isomeri. Per esempiu, l'autore hà utilizatu una colonna chirale di 5 μm * 4,6 mm * 250 mm per separà i dui isomeri di 1,2-diphenylethylenediamine: (1S, 2S)-1, 2-diphenylethylenediamine è (1R, 2R)-1, 2 -diphenylethylenediamine, è a siparazione trà i dui righjuntu circa 2,0. In ogni casu, i culonni chirali sò più caru di l'altri tipi di culonni, di solitu 1W +/piece. Se ci hè bisognu di tali culonni, l'unità hà bisognu di fà un budgetu abbastanza. 3.5 Colonna di scambiu di ioni
I culonni di scambiu di ioni sò adattati per a separazione è l'analisi di ioni carichi, cum'è ioni, proteini, acidi nucleici è certi sustanzi di zuccaru. Sicondu u tipu di riempimentu, sò spartuti in culonni di scambiu di cationi, culonni di scambiu di anioni è forti colonne di scambiu di cationi.
I culonni di scambiu di cationi includenu colonne basati in calciu è idrogenu, chì sò principarmenti adattati per l'analisi di sustanzi cationichi cum'è l'aminoacidi. Per esempiu, l'autore hà utilizatu culonni basati in calcium quandu analizà u gluconate di calcium è l'acetate di calcium in una suluzione di flussu. E duie sustanzi anu risposti forti à λ=210nm, è u gradu di separazione righjunghji 3.0; l'autore hà utilizatu culonni basati in l'idrogenu per analizà e sustanzi ligati à u glucose. Diversi sustanzi principali ligati - maltose, maltotriose è fructose - avianu una sensibilità alta sottu detectors differenziali, cù un limitu di deteczione di 0,5 ppm è un gradu di separazione di 2,0-2,5.
I culonni di scambiu anioni sò principarmenti adattati per l'analisi di sustanzi anionici cum'è l'acidi organici è l'ioni alogeni; e culonni di scambiu di cationi forti anu una capacità di scambiu di ioni più altu è selettività, è sò adattati per a separazione è l'analisi di campioni cumplessi.
Ciò chì sopra hè solu una introduzione à i tipi è l'applicazioni di parechje colonne di cromatografia liquida cumminata cù l'esperienza di l'autore. Ci sò altri tipi speciali di colonne cromatografiche in applicazioni attuali, cum'è colonne cromatografiche à pori grossi, colonne cromatografiche à pori chjuchi, colonne cromatografiche d'affinità, colonne cromatografiche multimode, colonne cromatografiche liquidi ultra-alta prestazione (UHPLC), colonne cromatografiche fluide supercritiche. SFC), etc. Anu un rolu impurtante in diversi campi. U tipu specificu di colonna cromatografica deve esse sceltu secondu a struttura è e proprietà di a mostra, esigenze di separazione è altri scopi.
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